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重组表达载体的构建方法及步骤

构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术,是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。

一. 载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。

一个质粒的组成要素:

1) 复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

2) 抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+1Kan+

3) 多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段

4) P/E启动子/增强子

5) Terms终止信号

6) poly(A)信号可以起到稳定mRNA作用

选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点:

1. 构建DNA重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

2. 载体的类型:

1) 克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。

2) 表达载体根据受体细胞类型分类-原核/真核/穿梭,E. coli/哺乳类细胞表达载体。

3) 对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

3. 载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。

综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求:

1. 选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多;

2. 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒 <10个。

3. 必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

4. 必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。

5. 满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。

无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得线性载体分子,以便于与目的基因片段进行连接。

如何阅读质粒图谱

第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)

第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。

1) Ampr水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。

2) tetr可以阻止四环素进入细胞。

3) camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。

4) neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使 G418(长那霉素衍生物)失活

5) hygr使潮霉素-β失活。

第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步:再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说,外源 DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。

第六步:启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号

1) 启动子-促进DNA转录的DNA序列,这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列的上游,是DNA分子上可以与RNA-pol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。

2) 增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。

3) 核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。

4) 转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。

质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上根据表达宿主不同,构建时所选择的载体也会不同。

二. 目的基因的获取

目的DNA的获取需根据其目的基因序列和启动子序列设计引物,为提高目的基因产率,采用两次PCR的方法,即第一次设计引物扩增全序列基因,第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增,进而加尾连接到T-DNA上,再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。

引物设计

第一次引物设计:

  正向引物: sinn3F    冰盒标注:P2a

      引物序列:5’— AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’

      引物长度:25bp

  反向引物:sinn3R    冰盒标注:P2b

      引物序列:5’— GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’

      引物长度:22bp

第二次引物设计(带酶切位点):

  正向引物: sinn3FE   冰盒标注:P2c

      引物序列:5’— ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’

      引物长度:34bp

  反向引物:sinn3RE   冰盒标注:P2d

      引物序列:5’— TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’

      引物长度:34bp

PCR扩增

PCR即聚合酶链式反应是指在DNA聚合酶的催化下以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点通过变性、延伸、复性等步骤体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程是一项DNA体外合成放大技术可用于基因分离克隆序列分析基因表达调控基因多态性研究等许多方面

  PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2

PCR反应的基本步骤

变性高温使双链DNA解离成单链94℃  30s)

退火低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子55℃  30s)  

延伸中温延伸 DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下 DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5’向3’方向的延伸合成出与模板DNA链互补的DNA子链 70-72℃  30-60s)

以上三个步骤为一循环每一循环的产物均可作为下一循环的模板经过n次循环后目的DNA以2n形式增加

PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法

PCR反应体系

第一次PCR扩增:

调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件,经多次反复试验结果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带(1kb):

  PCR反应体系2*100ul(每管25ul,共8管)

Pyrobest

2ul

buffer(10x)

10ul

WT4(模板)

2ul

P2a(10uM)

4ul

P2b(10uM)

4ul

dNTP(25x)

2ul

ddH2O

76ul

PCR反应条件

 

30 cycles

 

 

94℃

 94℃

54℃

72℃

72℃

4℃

5min

40s

40s

2min30s

10min

forever

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA条带共切3管分别标注A、B、C首先用25ul约60℃的无菌蒸馏水洗脱A管一次洗脱液标注1分别用15ul的无菌蒸馏水洗脱B管和C管得到的DNA洗脱液标注2最后各用30ul的无菌蒸馏水洗脱A、B、C管得到的DNA洗脱液分别标注a、b、c

第二次PCR扩增(带酶切位点)

分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板进行第二次PCR扩增设计反应体系(各25ul)如下

 

模板2

模板a

模板b

模板c

Pyrobest

0.5ul

0.5ul

0.5ul

0.5ul

buffer(10x)

2.5ul

2.5ul

2.5ul

2.5ul

模板

0.5ul

2ul

4ul

6ul

P2a(10uM)

1ul

1ul

1ul

1ul

P2b(10uM)

1ul

1ul

1ul

1ul

dNTP(25x)

0.5ul

0.5ul

0.5ul

0.5ul

ddH2O

19ul

17.5ul

15.5ul

13.5ul

PCR反应条件

 

30 cycles

 

 

94℃

 94℃

54℃

72℃

72℃

4℃

5min

40s

40s

2min30s

10min

forever

电泳结果表明2管和c管为模板可得到明显的目的基因条带依据此次电泳结果可先后再利用PCR扩增(各100ul每管25ul8管)

PCR反应体系2*100ul(每管25ul8管)

 

模板2

模板c

Pyrobest

2ul

2ul

buffer(10x)

10ul

10ul

模板

4ul

40ul

P2a(10uM)

4ul

4ul

P2b(10uM)

4ul

4ul

dNTP(2.5x)

2ul

2ul

ddH2O

74ul

38ul

PCR反应条件

 

30 cycles

 

 

94℃

94℃

54℃

72℃

72℃

4℃

5min

40s

40s

2min30s

10min

forever

电泳条带明显而且明亮切胶回收保存待用。

电泳实验流程

1. 配胶

1) 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(1X TAE Buffer)

2) 根据制胶量和凝胶浓度,准确称量琼脂糖粉(1g)加入适当的锥形瓶中。

3) 加入一定量的电泳缓冲液(1X TAE Buffer 100ml)。

4) 熔化完全,冷却至600C左右,加入EB5-7ul,充分混匀。

5) 将溶液倒入制胶模中,之前应在适当位置插上梳子。

6) 室温下凝固,不立即使用时,可用保鲜膜将凝胶包好后放40C保存,一般可保存2-5天。

2. 电泳

取适量的PCR产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中,另取适量的DNA Maker 加入右边槽中,开始电泳。

3. 紫外观察电泳条带

当溴酚蓝跑到适当位置时,在紫外光下观察目的基因的电泳条带(1kb处)

4. 切胶回收目的DNA

目的DNA加尾

25ul的无菌蒸馏水洗脱DNA,再用20ul的无菌蒸馏水洗脱,共得约40ul的洗脱液,然后抽真空使其浓缩至约8ul。

加尾10ul体系:

DNA

8ul

Buffer(10x)

1ul

dATP

0.5ul

Taq酶

0.5ul

PCR条件:72℃ 30-40min  降至4℃即可              

连接T-DNA

连接10ul体系:

T4 ligase

1ul

Buffer(10x)

1ul

T-DNA

1ul

DNA-PolyA

7ul

连接条件: 4000rpm甩30sec   4℃过夜

三. 感受态DH5α的制备

转化是将外源DNA分子引入受体细菌使之获得新的遗传性状受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体可以容忍外源的DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代受体细胞经过一些特殊的方法如电击、CaCl2等化学试剂处理后细胞膜的通透性增加成为感受态细胞使外源的DNA分子可以进入

CaCl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤

1. 配制0.05mol/l的CaCl2-15%的甘油混合溶液高温高压灭菌CaCl2必须为分析纯以上

2. 实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净高温高压灭菌最好有用于制备感受态细胞的一套专用器材

3. 受体菌的培养从非选择性LB培养基上挑取E. coli单菌落接种于3-5ml LB液体培养基中37℃振荡培养过夜至对数生长期中后期将该菌悬液以1100的比例接种于50-100ml LB培养基中37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5培养时间不宜超过2.5小时否则不能达到最高转化效率

实验步骤

1) 细菌的收获培养液冰浴5分钟后4℃ 5000rpm离心5分钟

2) 用欲冷的去离子水洗涤沉淀4℃ 5000rpm离心5分钟

3) 沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15%的甘油混合溶液轻吹散冰浴5分钟0.05mol/l的CaCl2-15%的甘油混合溶液

4) 沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的CaCl2-15%的甘油混合溶液轻吹散即成为感受态细胞悬液分装成50-100ul的小份置于-70℃可保存半年

最好在两个月内用完然后重新制备若要进一步提高转化效率可将加入的溶液体积减少到1ml或分装成200ul/管

电转化法制备感受态大肠杆菌的方法步骤

1) 前夜接种受体菌(DH5α)挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜

2) 2ml过夜培养物接种于200ml LB培养基中37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.5(约2.5-3小时)

3) 将菌液迅速置于冰上以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

4) 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中在冰上冷却10分钟

5) 4℃ 3000rpm冷冻离心5分钟

6) 弃去上清加入1500ul冰冷的10%甘油用移液枪上下吸动打匀使细胞重新悬浮

7) 4℃ 3000rpm冷冻离心5分钟

8) 弃去上清加入750ul冰冷的10%甘油用移液枪上下吸动打匀使细胞重新悬浮

9) 4℃3000rpm冷冻离心5分钟

10) 加入20ul冰冷的10%甘油用移液枪上下吸动打匀使细胞重新悬浮

11) 立即使用或迅速置于-70℃超低温保存

四. 转化

基本原理

感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子PUC18的LacZ基因区域当有DNA片段插入时LacZ基因失活转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal生长时会产生白色的克隆不含插入片段的PUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落

方法步骤

1) 在已制好的LB液体培养基(各250ml)中分别加入氨苄青霉素250ul和卡那霉素500ml摇匀后倒无菌平板各倒7个待凝固

2) 用无水乙醇清洗浸泡在75%乙醇中的电击杯于超净工作台桑吹干或烘箱中烘干将连接产物和01CM的电击被杯一起置于冰上预冷准备3管800ul的无抗LB于冰上预冷

3) -70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上解冻

4) 3ul连接产物加入到50-100ul感受态细胞中混匀后转入电击杯中轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电击杯的底部

5) 打开电转仪将电击杯放入

6) 按一下Pulse键听到蜂鸣声后向电击杯中迅速加入800ul的LB培养基重新悬浮细胞后转移到15ml的离心管中

7) 37℃100rpm复苏1-15h

8) 5000rpm离心5分钟弃上清剩100ul10-50ul(40ul)涂板放于37℃过夜培养次日查看转化结果